重组人表皮生长因子和碱性成纤维生长因子促进人角膜上皮细胞的增殖

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.07.011

摘要/Abstract

摘要：

背景：重组人表皮生长因子和碱性成纤维生长因子的制剂临床上已经用于眼表创伤的修复，但是对于使用何种浓度的生长因子就能够最大程度的促进愈合以及两种生长因子促进创面愈合的效果比较一直存在争议。
目的：初步观察重组人表皮生长因子、碱性成纤维生长因子对培养的人角膜上皮细胞克隆的影响。
方法：用不同浓度的重组人表皮生长因子和碱性成纤维生长因子作用于体外培养的人角膜上皮细胞，应用四甲基偶氮唑盐比色法分别在不同浓度的生长因子作用人角膜上皮细胞3，5，7 d后检测人角膜上皮细胞的增殖能力；平板克隆形成实验法观察细胞克隆形态及计算细胞克隆形成率。
结果与结论：不同质量浓度的重组人表皮生长因子和碱性成纤维生长因子分别对人角膜上皮细胞干预5 d后，重组人表皮生长因子和碱性成纤维生长因子在10 μg/L质量浓度时MTT值最大；质量浓度10 μg/L重组人表皮生长因子促进人角膜上皮细胞克隆形成率高于质量浓度10 μg/L碱性成纤维生长因子(P=0.02)。结果证实，重组人表皮生长因子和碱性成纤维生长因子均能促进人角膜上皮细胞增殖并增加其克隆形成能力。质量浓度10 μg/L 重组人表皮生长因子干预5 d促进人角膜上皮细胞克隆形成效果最好。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

关键词: 组织构建, 组织工程, 碱性成纤维细胞生长因子, 重组人表皮生长因子, 人角膜上皮细胞, 细胞克隆

Abstract:

BACKGROUND: The preparation of recombinant human epidermal growth factor (rhEGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) has been clinically used in the repair of ocular surface trauma. However, the concentration of these growth factors that achieve the maximal healing effect and the comparison of two kinds of growth factors on promoting wound healing are still controversial.
OBJECTIVE: To investigate the effect of rhEGF and bFGF on the cloning of human corneal epithelial cells.
METHODS: The human corneal epithelial cells cultured in vitro were interfered with rhEGF and bFGF under different concentrations. The proliferation of human corneal epithelial cells was detected using MTT assay after 3, 5, 7 days of growth factors treatment. Plate clone formation assay was applied to observe the morphology of cell clone and analyze clone formation rate of human corneal epithelial cells.
RESULTS and CONCLUSION: MTT value shows that 10 μg/L rhEGF and 10 μg/L bFGF on day 5 were the most powerful concentration. The clone formation rate of human corneal epithelial cells after treated with 10 μg/L rhEGF was higher than that with 10 μg/L bFGF (P = 0.02). The results confirmed that both rhEGF and bFGF could promote the proliferation and increase clone formation ability of human corneal epithelial cells. 10 μg/L rhEGF for 5 days achieves the best effect on promoting clone formation of human corneal epithelium cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

Key words: epidermal growth factor, fibroblast growth factor, corneal epithelium

中图分类号:

R318

彭艳阳，吴伟，曾丽娜，陈晓红，陆晓和. 重组人表皮生长因子和碱性成纤维生长因子促进人角膜上皮细胞的增殖[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(7): 1045-1050.

Peng Yan-yang, Wu Wei, Zeng Li-na, Chen Xiao-hong, Lu Xiao-he . Recombinant human epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor promote the proliferation of human corneal epithelial cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(7): 1045-1050.

图/表（结果） 1

参考文献

[1] Williams KA, Irani YD, Klebe S. Novel therapeutic approaches for corneal disease. Discov Med. 2013;15(84):291-299.

[2] Huo Y, Qiu WY, Pan Q, et al. Reactive oxygen species (ROS) are essential mediators in epidermal growth factor (EGF)-stimulated corneal epithelial cell proliferation, adhesion, migration, and wound healing. Exp Eye Res. 2009;89(6): 876-886.

[3] Li H, Miao J, Zhao G, et al. Different expression patterns of growth factors in rat fetuses with spina bifida aperta after in utero mesenchymal stromal cell transplantation. Cytotherapy. 2013.

[4] Suzuki K, Saito J, Yanai R, et al. Cell-matrix and cell-cell interactions during corneal epithelial wound healing. Prog Retin Eye Res. 2003;22(2):113-133.

[5] Scholl S, Kirchhof J, Augustin A J. Antivascular endothelial growth factors in anterior segment diseases. Dev Ophthalmol. 2010;46:133-139.

[6] Lyu J, Joo CK. Wnt-7a up-regulates matrix metalloproteinase-12 expression and promotes cell proliferation in corneal epithelial cells during wound healing. J Biol Chem. 2005;280(22):21653-21660.

[7] Klenkler B, Sheardown H. Growth factors in the anterior segment: role in tissue maintenance, wound healing and ocular pathology. Exp Eye Res. 2004;79(5):677-688.

[8] Yoshioka R, Shiraishi A, Kobayashi T, et al. Corneal epithelial wound healing impaired in keratinocyte-specific HB-EGF-deficient mice in vivo and in vitro. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2010;51(11):5630-5639.

[9] Hecquet C, Morisset S, Lorans G, et al. Effects of acidic and basic fibroblast growth factors on the proliferation of rabbit corneal cells. Curr Eye Res. 1990;9(5):429-433.

[10] Bremnes RM, Camps C, Sirera R. Angiogenesis in non-small cell lung cancer: the prognostic impact of neoangiogenesis and the cytokines VEGF and bFGF in tumours and blood. Lung Cancer. 2006;51(2):143-158.

[11] Liu J, Song G, Wang Z, et al. Establishment of a corneal epithelial cell line spontaneously derived from human limbal cells. Exp Eye Res. 2007;84(3):599-609.

[12] Stockert J C, Blazquez-Castro A, Canete M, et al. MTT assay for cell viability: Intracellular localization of the formazan product is in lipid droplets. Acta Histochem. 2012;114(8):785-796.

[13] Bennett NT, Schultz GS. Growth factors and wound healing: Part II. Role in normal and chronic wound healing. Am J Surg. 1993;166(1):74-81.

[14] Thalmann-Goetsch A, Engelmann K, Bednarz J. Comparative study on the effects of different growth factors on migration of bovine corneal endothelial cells during wound healing. Acta Ophthalmol Scand. 1997;75(5):490-495.

[15] Brown AC, Adams D, de Caestecker M, et al. FGF/EGF signaling regulates the renewal of early nephron progenitors during embryonic development. Development. 2011;138(23): 5099-5112.

[16] Mie M, Sasaki S, Kobatake E. Construction of a bFGF-tethered multi-functional extracellular matrix protein through coiled-coil structures for neurite outgrowth induction. Biomed Mater. 2013;9(1):015004.

[17] Zhou W, Zhao M, Zhao Y, et al. A fibrin gel loaded with chitosan nanoparticles for local delivery of rhEGF: preparation and in vitro release studies. J Mater Sci Mater Med. 2011; 22(5): 1221-1230.

[18] Yanai R, Yamada N, Inui M, et al. Correlation of proliferative and anti-apoptotic effects of HGF, insulin, IGF-1, IGF-2, and EGF in SV40-transformed human corneal epithelial cells. Exp Eye Res. 2006;83(1):76-83.

[19] Liu Z, Carvajal M, Carraway CA, et al. Expression of the receptor tyrosine kinases, epidermal growth factor receptor, ErbB2, and ErbB3, in human ocular surface epithelia. Cornea. 2001;20(1):81-85.

[20] Wilson SE, He YG, Weng J, et al. Effect of epidermal growth factor, hepatocyte growth factor, and keratinocyte growth factor, on proliferation, motility and differentiation of human corneal epithelial cells. Exp Eye Res. 1994;59(6):665-678.

[21] Stojanovic A, Chen X, Jin N, et al. Safety and efficacy of epithelium-on corneal collagen cross-linking using a multifactorial approach to achieve proper stromal riboflavin saturation. J Ophthalmol. 2012;2012:498435.

[22] Gospodarowicz D, Ferrara N, Schweigerer L, et al. Structural characterization and biological functions of fibroblast growth factor. Endocr Rev. 1987;8(2):95-114.

[23] 傅小兵,沈祖尧,陈玉林,等.碱性成纤维细胞生长因子与创面修复-1024例多中心对照临床试验结果[J].中国修复重建外科杂志,1998,(4):22-24.

[24] Gainza G, Aguirre J J, Pedraz JL, et al. rhEGF-loaded PLGA-Alginate microspheres enhance the healing of full-thickness excisional wounds in diabetised Wistar rats. Eur J Pharm Sci. 2013;50(3-4):243-252.

[25] Wang Z, Zhong H, Yang Z, et al. Exogenous bFGF or TGFbeta accelerates healing of reconstructed dura by CO laser soldering in minipigs. Lasers Med Sci. 2013.

[26] Xing B, Wu F, Li T, et al. Experimental study of comparing rhEGF with rhbetaFGF on improving the quality of wound healing. Int J Clin Exp Med. 2013;6(8):655-661.

[27] Han KY, Fahd DC, Tshionyi M, et al. MT1-MMP modulates bFGF-induced VEGF-A expression in corneal fibroblasts. Protein Pept Lett. 2012;19(12):1334-1339.

[28] Vadlapudi AD, Vadlapatla RK, Pal D, et al. Functional and molecular aspects of biotin uptake via SMVT in human corneal epithelial (HCEC) and retinal pigment epithelial (D407) cells. AAPS J. 2012;14(4):832-842.

[29] Chandrasekher G, Pothula S, Maharaj G, et al. Differential effects of hepatocyte growth factor and keratinocyte growth factor on corneal epithelial cell cycle protein expression, cell survival, and growth. Mol Vis. 2014;20:24.

[30] Wright B, Hopkinson A, Leyland M, et al. The secretome of alginate-encapsulated limbal epithelial stem cells modulates corneal epithelial cell proliferation. PLoS One. 2013;8(7): e70860.

[31] Kitazawa K, Kawasaki S, Shinomiya K, et al. Establishment of a human corneal epithelial cell line lacking the functional TACSTD2 gene as an in vitro model for gelatinous drop-like dystrophy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2013;54(8):5701-5711.

[32] Liu J, Lawrence BD, Liu A, et al. Silk fibroin as a biomaterial substrate for corneal epithelial cell sheet generation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2012;53(7):4130-4138.

[33] Ghaffarieh A, Ghaffarpasand F, Dehghankhalili M, et al. Effect of transcutaneous electrical stimulation on rabbit corneal epithelial cell migration. Cornea. 2012;31(5): 559-563.

[34] Wang Z, Bildin VN, Yang H, et al. Dependence of corneal epithelial cell proliferation on modulation of interactions between ERK1/2 and NKCC1. Cell Physiol Biochem. 2011; 28(4):703-714.

[35] Tocce EJ, Broderick AH, Murphy KC, et al. Functionalization of reactive polymer multilayers with RGD and an antifouling motif: RGD density provides control over human corneal epithelial cell-substrate interactions. J Biomed Mater Res A. 2012;100(1):84-93.

[36] Okada N, Kawakita T, Mishima K, et al. Clusterin promotes corneal epithelial cell growth through upregulation of hepatocyte growth factor by mesenchymal cells in vitro. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011;52(6): 2905-2910.

[37] Ding L, Gao LJ, Gu PQ, et al. The role of eIF5A in epidermal growth factor-induced proliferation of corneal epithelial cell association with PI3-k/Akt activation.Mol Vis. 2011;17:16-22.

[38] Fan TJ, Xu B, Zhao J, et al. Establishment of an untransfected human corneal epithelial cell line and its biocompatibility with denuded amniotic membrane. Int J Ophthalmol. 2011;4(3):228-234.

[39] Imanishi J, Kamiyama K, Iguchi I, et al. Growth factors: importance in wound healing and maintenance of transparency of the cornea. Prog Retin Eye Res. 2000;19(1): 113-129.

[40] Declair V. The importance of growth factors in wound healing. Ostomy Wound Manage.1999;45(4):64-74.

[41] 班胜刚,李永均,卢荣强,等.重组人表皮生长因子治疗外伤性角膜上皮缺损[J].眼外伤职业眼病杂志,2005,(1):26-27.

引言

近年来各种原因所致眼部外伤日益增多，另外，屈光手术是临床眼科治疗近视、远视、散光最常见的外科疗法，术后角膜创伤修复对减轻疼痛及实现最佳视觉修正显得尤为重要^[1]。因此，外伤或者手术等引起创伤修复在外科及眼科领域非常常见，临床上发病率比较高，患病人群比较多，严重的眼外伤可以导致角膜盲等严重视力损害。

眼表主要由上下眼睑缘间的角膜和结膜组成，正常透明的角膜是由角膜上皮层，前弹力层，基质层，后弹力层和内皮层五部分组成，约占眼外层纤维膜的1/6，表面被泪膜覆盖，无新生血管和淋巴管，其中角膜上皮层是由4-6层非角化的复层鳞状上皮紧密排列而成。角膜上皮质厚度约0.05 mm。占整个角膜厚度的5%，角膜缘上皮基底层含有角膜缘干细胞，可逐渐分化为瞬间扩充细胞和终末分化上皮细胞，是角膜上皮增殖和修复的来源，其生命周期为7-14 d。角膜上皮质可分为细胞层和基底膜，细胞层包括基底细胞，翼状细胞和表层细胞。基底膜由基底上皮细胞持续分泌，在其下形成由Ⅳ型胶原纤维，层粘连蛋白和其他蛋白组成的50 nm厚的一层膜。浅表上皮细胞之间的紧密连接可阻止泪液中的水分进入基底层，角膜上皮大范围缺损时可导致角膜水肿增厚、角膜透明性下降，从而严重影响视力。

完整的角膜上皮是眼球抵御病原微生物侵袭的第一道屏障，同时也是维持良好视觉的必需条件。角膜上皮同机体其它上皮组织一样，容易不断遭受外界物理、化学和生物等有害因子的侵袭，导致损伤和失去屏障功能。临床上，外伤、感染和手术等常易导致角膜上皮损伤，从而导致角膜新生血管、角膜白斑及角膜溃疡穿孔等严重并发症，严重影响视力。

因此，结构完整、功能健全的角膜上皮层是角膜抵御外界各种有害因素损伤和维持角膜透明及保证良好视觉功能的基本条件。由于正常透明角膜具有无血管特点，其主要由泪液和角膜缘血管网和房水提供营养。眼外伤常常伴随角膜和结膜创伤，早期合理的角膜损伤修复对于维持角膜透明性和高清的视觉质量具有非常重要的作用。角膜上皮损伤修复主要由角膜上皮细胞分化及增殖、迁徙和角膜基质组织结构重建等过程组成^[2]。其损伤修复是一个复杂的细胞因子网络调节过程。在这个过程中，包括细胞与细胞间，细胞与基质间的相互调节作用。角膜上皮损伤后机体会发生一系列瀑布式反应，包括角膜上皮、基质细胞增殖，分化移行及凋亡和细胞间的相互接触信号调节等，泪液和角膜中的各种生长因子调节这一系列过程，介导角膜的损伤修复和稳定微环境，从而维持角膜的完整性。在这个角膜创伤修复的过程中伴随着重组人表皮生长因子与碱性成纤维细胞生长因子等相关生长因子释放进行网络调控^[3]。

角膜上皮损伤是临床上十分常见的一种体征，反复发作的角膜溃疡创伤后愈合非常缓慢，同时因角膜上皮层具有丰富的感觉神经末梢，常伴有剧烈的眼部刺痛，因此，早期快速治疗角膜上皮损伤修复，对于维持角膜透明性，保护患者视力具有重要的作用^[4-5]。重组人表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子具有广泛的生物学效应，能极强地促进各种表皮组织生长，在临床医学上已用于烧烫伤、溃疡、各类创伤以及角膜损伤等的治疗^[6-7]。

Cohen教授合作，在小鼠颌下腺中发现了促神经生长激素物质。1962年，Cohen教授在研究小鼠颌下腺神经生长因子时，发现了表皮生长因子，并在随后的研究中逐步确定了表皮生长因子的一级、二级结构和空间结构。人们就表皮生长因子对培养的角膜细胞的促生长作用、表皮生长因子对各种动物角膜损伤的治疗作用、表皮生长因子的正常生理作用进行了大量研究，许多学者对其临床应用进行了深入探讨，展现了广泛的应用前景。

关于碱性成纤维生长因子，1974年，英国Gospodarowicz教授从牛脑垂体中纯化出一种细胞生长因子，因首先发现对某些细胞成纤维有明显的促分裂增殖活性，而被命名为碱性成纤维生长因子。其在体内广泛分布于眼、脑、心、肝、骨、肾上腺和胎盘等组织中，以脑和垂体中含量为最高。近年来，对碱性成纤维生长因子的生物活性的研究日益受到重视，且应用基因工程技术生产的碱性成纤维细胞生长因子已被应用于临床的创伤修复、慢性创面治疗、溃疡病及帕金森症等神经系统疾病和角膜损伤修复的治疗。

目前研究发现，重组人表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子作为临床上常用的两类促进角膜上皮损伤愈合的细胞因子，两者的机制及侧重点不同^[8-10]。重组人表皮生长因子主要通过促进角膜缘基底膜细胞向表层移行，先形成单细胞层，然后经有丝分裂形成复层上皮细胞而加速角膜创面的上皮化。碱性成纤维细胞生长因子主要是通过促分裂效应和非促分裂的激素样活性，特别是通过激活角膜基质成纤维细胞分裂增殖活性，使胶原纤维分泌增加、毛细血管增多和官腔扩张而发挥促修复作用。而在眼科临床上，何种浓度的生长因子促进角膜上皮修复效果最好，两者比较促进角膜上皮损伤修复效果如何？目前尚未见此方面系统的实验研究，为了更合理、更安全地指导临床用药，确定临床用药的最佳浓度，探讨两者对眼表创伤愈合的效果，实验采用体外培养人角膜上皮细胞，比较两者与人角膜上皮细胞克隆的时效及量效关系，为临床选择最佳用药种类、浓度及疗程提供初步依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

材料方法

设计：细胞学体外实验。

时间及地点：于2012年6月至2013年6月在南方医科大学珠江医院中心实验室完成。

材料：

实验方法：

筛选碱性成纤维细胞生长因子与重组人表皮生长因子作用于人角膜上皮细胞增殖的最佳浓度及确定最佳作用时间点：将人角膜上皮细胞复苏进行传代培养^[11]。将同一代人角膜上皮细胞细胞株接种于96孔板中，每个孔中加 200 μL角膜上皮细胞悬液(含体积分数10% FBS的DMEM)，1 000个细胞/孔，每组5个复孔，温箱培养24 h后，各孔分别加入质量浓度5，10，20 μg/L 重组人表皮生长因子的DMEM培养液(含体积分数10%胎牛血清)，质量浓度2.5，5，10，20，40 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的DMEM培养液(含体积分数10%胎牛血清)。并设空白对照组(角膜上皮细胞悬液正常培养，不加任何干预)作对照。每日换液1次，分别于培养3，5，7 d后在倒置显微镜下观察和记录细胞的形态和增殖，同时应用MTT法检测人角膜上皮细胞细胞的增殖能力^[12]，于波长为570 nm下酶标仪测定各孔吸光度值，绘制不同浓度不同时间点重组人表皮生长因子与碱性成纤维细胞生长因子作用于人角膜上皮细胞的细胞增殖曲线图，每组实验重复3次。

实验采用细胞平板克隆形成实验观察了重组人表皮生长因子与碱性成纤维细胞生长因子对人角膜上皮细胞的细胞平板克隆形成的影响：消化对数生长期的人角膜上皮细胞，离心、计数和重新悬液后，接种于6孔板中，每孔接种100个人角膜上皮细胞。培养12 h待细胞基本贴壁后，实验随机分为4组，4组的角膜上皮细胞培养液均采用高糖DMEM 培养液(其中加入体积分数10%胎牛血清、转铁蛋白、胰岛素、肾上腺激素、NEAA、谷氨酰胺、青链霉素双抗)。培养，空白对照组正常培养不加任何干预，其他3组分别加入质量浓度10 μg/L的重组人表皮生长因子，质量浓度为10，20 μg/L的碱性成纤维细胞生长因子培养。细胞培养箱中静置培养，隔日半量换液，实验重复3次。培养5 d后，弃去培养液，用PBS轻轻漂洗后，加入固定液(甲醇/冰醋酸=3∶1)20 min固定。再次PBS冲洗，应用Giemsa染色法(1∶10稀释)染色10 min，用自来水冲洗后，在光学显微镜下拍照观察细胞克隆形态，阳性细胞呈蓝色，在光学显微镜下计数。计算细胞克隆形成数目(>8个细胞数目为1个克隆)和克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%，每组实验重复3次。

主要观察指标：MTT细胞增殖结果吸光度值，细胞克隆形成数目和细胞克隆形成率。

统计学分析：采用SPSS 13.0软件包对数据进行分析，数据资料以x(_)±s表示，经过方差齐性检验后，组建数据差异的检测采用Kruskal-Wallis H 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

讨论

创伤后组织的修复是一个非常复杂的病理生理过程，眼表的完整及角膜组织的创伤愈合需要细胞的增殖、分化、迁移与细胞凋亡过程保持精细的平衡。为实现这一平衡，一系列生长因子参与其中，而重组人表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子这两种生长因子在创伤修复领域研究比较多，而且是最早期进入临床应用的基因工程药物^[13-14]。

大量基础实验发现，重组人表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子各自通过复杂的生理生化途径发挥促创面修复作用^[15-17]。表皮生长因子是表皮细胞、上皮细胞和间充质细胞等最有力的促细胞生长因子，具有显著增加上皮细胞的增生及分化、抑制角膜上皮细胞的凋亡等功能^[18]。表皮细胞生长因子广泛分布在人体各种组织与体液中，其中房水和泪液中均含有表皮细胞生长因子受体，无论是在正常情况下或者是在角膜损伤修复过程中，表皮细胞生长因子都是维持角膜上皮透明完整的必要因素^[19]。表皮细胞生长因子促进角膜上皮细胞增殖的作用主要是由于其与角膜上皮细胞表面的表皮细胞生长因子受体结合，形成表皮细胞生长因子受体复合体，然后促进角膜上皮细胞摄取DNA、RNA和标志蛋白前体，从而促进细胞的有丝分裂，使细胞数量增加^[20]。重组人表皮生长因子是采用生物DNA重组技术，生产的高纯度重组人表皮生长因子的衍生物，研究发现，重组人表皮生长因子衍生物对人角膜上皮细胞的增殖具有促进的作用，并且能刺激角膜基质或成纤维细胞的增殖，从而促使角膜胶原纤维板层的排列更加接近于正常人的合理排列趋势，并且，机体组织中的表皮细胞生长因子含量普遍较低,因此应用外源性重组人表皮生长因子治疗体表创伤以补充内源性的表皮细胞生长因子不足，对于启动和调控机体组织细胞的增殖、加速创面修复具有非常重要的临床意义^[21]。碱性成纤维细胞生长因子包含146个氨基酸，是一种重要的促进细胞分裂生长的生长因子，通过与其相应受体结合发挥生物学作用。一系列的体外实验研究证实，碱性成纤维细胞生长因子对上皮细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞具有增殖、迁移及趋化作用^[22]。许多临床研究已经证实了碱性成纤维细胞生长因子对烧伤、外伤及各种慢性难愈合创面的修复均具有显著的作用^[23]。

目前已有相关研究表明：虽然重组人表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子这两种生长因子，都可以促进创面修复，但这二者的效应重点是具有差别不同的^[24-25]。Xing等^[26]研究发现，重组人表皮生长因子主要对创伤再生上皮化作用非常显著，而碱性成纤维细胞生长因子则主要促进机体创面的肉芽组织生长。有研究发现，碱性成纤维细胞生长因子可以促进血管内皮细胞增殖分化，诱发新生毛细血管内皮细胞侵入三维胶原基质中，形成类似于毛细血管的管样组织结构，从而促进血管新生^[27]。角膜上皮细胞的增殖是角膜上皮创伤修复的关键^[28-38]，目前尚未见系统比较重组人表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对角膜上皮细胞增殖克隆的量效及时效关系的实验研究，因此，进一步研究明确重组人表皮生长因子与碱性成纤维细胞生长因子促进角膜上皮损伤修复各自不同效果特点，这对于更加合理和安全地指导临床用药，从而确定两者临床应用的最佳时机具有非常重要意义。

创伤修复是一个复杂而有序的生物学过程，其中促进细胞增殖克隆成为伤口愈合的关键。实验通过多次MTT细胞增殖实验，发现重组人表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子促进同代人角膜上皮细胞增殖的最佳培养时间为第5天，最佳质量浓度为10 μg/L，这和相关文献报道基本一致^[39-40]。因此，在此最佳浓度作用下，实验选择了可反映单个细胞增殖能力的平板克隆实验，证实质量浓度 10 μg/L 重组人表皮生长因子组促进人角膜上皮细胞克隆形成数目较碱性成纤维细胞生长因子多有统计学差异，表现为重组人表皮生长因子组细胞平板单克隆形成的数量较碱性成纤维细胞生长因子多，细胞的总量较碱性成纤维细胞生长因子高，从而为临床用药提供初步可靠依据。然而，单一应用某一种生长因子并不能解决角膜外伤治疗上所面临的所有问题，如重组人表皮生长因子存在它刺激产生的上皮与基质粘附不牢，碱性成纤维细胞生长因子刺激增加上皮新生血管化的问题^{[27, 41]}。本次实验只能反映不同浓度重组人表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子在体外对人角膜上皮细胞增殖克隆的影响，还需要体内实验进一步证实及体外实验进一步研究其对角膜基质细胞、血管内皮细胞等的作用，明确重组人表皮生长因子与碱性成纤维细胞生长因子促进角膜上皮损伤修复效果以及是否诱导角膜新生血管和角膜瘢痕；另外，其促进人角膜上皮细胞增殖克隆的作用机制尚需要深入探讨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：